DNTP是deoxy-ribonucleoside triphosphate(脫氧核糖核苷三磷酸)的縮寫，是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，N是指含氮堿基，代表變量指代A、T、G、C等中的一種。在生物DNA合成中，以及各種PCR(RT-PCR(reverse transcription PCR)、Real-time PCR)中起原料作用。這些化合物屬于大極性化合物，常規(guī)的反相色譜柱通常難以保留，而使用離子對(duì)試劑，方法的耐用性會(huì)受到挑戰(zhàn)。
Hypercarb 填料為100% 的多孔石墨化碳(PGC)，球形全多孔顆粒。碳原子排列成六邊形為骨架的多片層結(jié)構(gòu)，因此，填料表面為純晶狀結(jié)構(gòu)，沒(méi)有任何其它的亞孔或鍵合相?；谶@一特點(diǎn)，Hypercarb色譜柱具有不同于硅膠基質(zhì)固定相的獨(dú)特性質(zhì)。Hypercarb 對(duì)各種流動(dòng)相溶劑都表現(xiàn)出極佳的穩(wěn)定性，pH 在 1-14 之間的流動(dòng)相皆可用于分離?；贖ypercarb 獨(dú)特的疏水和電子云保留機(jī)理，它非常適合解決反相和正相 HPLC 及 LC/MS 應(yīng)用中的“高挑戰(zhàn)樣品”分離，能夠以超凡能力保留強(qiáng)極性目標(biāo)物并分離結(jié)構(gòu)性質(zhì)接近的化合物。
本文采用黑科技Hypercarb色譜柱，在堿性流動(dòng)相條件下，能夠充分保留和分離dNTP 4種化合物以及dCTP有關(guān)雜質(zhì)，重現(xiàn)性佳，同時(shí)對(duì)于類似結(jié)構(gòu)的極性化合物分離具有重大的參考意義。
實(shí)驗(yàn)方法
液相色譜方法
儀器：Vanquish Core HPLC
色譜柱：Hypercarb，150 x 2.1 mm，3 μm(P/N 35003-152130)
流動(dòng)相：A：己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸調(diào)pH=10 B: 乙腈
流 速：0.3 mL/min
柱 溫：30 ℃
進(jìn)樣量：5 μL
檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 254/272 nm
具體梯度條件參見(jiàn) AN_24053_CCS
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
dNTP 4種化合物分析
dNTPs是包含核苷和三磷酸基團(tuán)的大極性化合物，如使用反相色譜柱，流動(dòng)相添加離子對(duì)試劑是比較復(fù)雜的方法，同時(shí)不利于色譜柱壽命；在此之前，基于Hypercarb色譜柱耐受寬pH值(1-14)的特點(diǎn)， Hypercarb已成功應(yīng)用于堿性條件下分析核苷酸和阿糖胞苷類化合物等含有單磷酸或者多磷酸基團(tuán)的大極性化合物[1]，此方案同樣考慮在堿性條件下保留和分離dNTPs。
參考阿糖胞苷測(cè)試方法，流動(dòng)相A為己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸調(diào)pH=10，流動(dòng)相B為乙腈。圖1展示了優(yōu)化后梯度下的4種化合物單標(biāo)定位譜圖。
圖1. 4種dNTP化合物單標(biāo)定位譜圖
圖2展示了dNTP 4種化合物重復(fù)性譜圖，連續(xù)6針，4種化合物保留時(shí)間和峰面積RSD均小于1%。
圖2. dNTP 4種化合物重復(fù)性譜圖(n=6)
在不同波長(zhǎng)下分析dNTP 4種化合物，如圖3所示，濃度均為50μM ，dCTP和dTTP在波長(zhǎng)為272nm時(shí)響應(yīng)更高，而dGTP和dATP在波長(zhǎng)為254nm時(shí)響應(yīng)更高，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求選擇更合適的波長(zhǎng)進(jìn)行分析。
圖3. 不同波長(zhǎng)下dNTP 4種化合物響應(yīng)譜圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
dCTP及相關(guān)雜質(zhì)分析
當(dāng)dCTP濃度為2.5 mM時(shí),通過(guò)優(yōu)化水相起始比例和梯度方法， dCTP和相關(guān)雜質(zhì)均可以分離，峰型較好。對(duì)dCTP及相關(guān)雜質(zhì)在Hypercarb色譜柱上保留和分離的重復(fù)性進(jìn)行了研究，如圖4所示，連續(xù)3針進(jìn)樣，重復(fù)性表現(xiàn)優(yōu)異，保留時(shí)間和峰面積RSD<1%。圖5展示了不同波長(zhǎng)下dCTP及相關(guān)雜質(zhì)響應(yīng)譜圖，可以看到272nm下，二磷酸雜質(zhì)和dCTP主峰響應(yīng)更高。
圖4. dCTP及相關(guān)雜質(zhì)重復(fù)性譜圖(n=3)
圖5. 不同波長(zhǎng)下dCTP及相關(guān)雜質(zhì)響應(yīng)譜圖
使用及維護(hù)
Hypercarb色譜柱使用及維護(hù)
Hypercarb色譜柱使用方法和反相色譜柱類似，但是由于其特殊的保留機(jī)理，流動(dòng)相添加劑和污染物容易吸附在石墨化碳表面，需要及時(shí)對(duì)色譜柱進(jìn)行清洗。本方案中，最高有機(jī)相比例為30%，需要定期使用高有機(jī)相沖洗色譜柱，一般建議80%乙腈沖洗20個(gè)柱體積以上。如果長(zhǎng)時(shí)間使用后污染較為嚴(yán)重，可以反接色譜柱，使用純乙腈低流速75℃柱溫下沖洗120個(gè)柱體積以上[2]。
總結(jié)
為解決dNTPs 以及dCTP有關(guān)雜質(zhì)這些大極性化合物的保留和分離問(wèn)題，本文基于賽默飛 Vanquish Core HPLC液相色譜系統(tǒng)，應(yīng)用Hypercarb色譜柱的特殊保留機(jī)理，開發(fā)了堿性流動(dòng)相條件下的分離方案。該方案操作簡(jiǎn)單，分離效果佳，重現(xiàn)性優(yōu)異，可為實(shí)驗(yàn)室保留分離同類型化合物提供參考方案，為分析人員帶來(lái)極大便利。
參考文獻(xiàn)：
[1] AN_21025_CCS_藥物_Hypercarb色譜柱用于核苷酸類及其磷酸化衍生物的分析
[2] ThermoFisher Scientific Hypercarb色譜柱方法開發(fā)指南
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